用粘质沙雷菌合成仿生离子取代和共取代羟基磷灰石纳米颗粒

　　摘要

　　仿生学作为生物陶瓷的重要组成部分，以其众多的功能优势而日益深入人心。天然羟基磷灰石(HA)除了主要的纳米结构外，还具有各种离子取代的特征。容易容纳这些关键元素到HA晶格是已知的，以提高骨愈合的生物陶瓷的性能。在这项工作中，通过仿生方法合成的羟基磷灰石被单个和多个阳离子所取代，以获得在骨修复中的潜在应用。利用生长在特定生物矿化介质中的沙雷氏菌，首次在HA上进行了Sr、Mg和Zn的离子置换。对沙雷菌HA (SHA)中不同浓度取代离子(Sr SHA、Mg SHA和Zn SHA)的结晶度、官能团、形态和晶体大小进行了分析。三者均表现出结晶度降低，相纯度降低，团聚体大，呈针状形貌。傅里叶变换红外光谱(FTIR)显示碳酸盐含量增加5.8%，与天然骨相似。此外，降低的O-H强度清楚地描述了HA晶格的破坏和随后的离子取代。本研究的新颖之处在于研究了1% Sr、Zn和Mg的组合在SHA中的共取代，并建立了相关的骨参数变化。扫描电子显微镜(SEM)和透射电子显微镜(TEM)图像清楚地显示了Sr SHA平均长度为20-50 nm，宽度为8-15 nm的均匀纳米团聚体;Zn SHA和Mg SHA均为10-40 nm长，8-10 nm宽，Sr, Zn, Mg SHA为40-70 nm长，4-10 nm宽。在个体和共取代中，没有观察到明显的峰移，可能是由于浓度较低。然而，在这两种情况下，细胞体积都增加了，因为Sr2+的存在证实了它在SHA晶格中的主导整合。利用能量色散x射线能谱(EDS)和电感耦合等离子体发射光谱仪(ICP-OES)对富微量离子沉积进行了定量分析。体外细胞毒性研究表明，NIH/3T3成纤维细胞、Mg -63骨肉瘤细胞和RAW 264.7巨噬细胞的细胞活力超过90%，证明了1% Sr、Zn和Mg在SHA中的生物相容性。沙雷菌的微生物生物矿化产生的HA纳米晶体模仿“骨状磷灰石”，其纯相、碳酸基、结晶度降低、纳米团聚、细胞参数变化、丰富的离子沉积和无毒性质证明了这一点。因此，离子取代和共取代生物矿化纳米SHA具有与人骨相似的特性，是解决骨损伤和促进再生的生物医学应用的合适候选材料。

　　简介

　　透明质酸是磷酸钙家族中*重要的物质之一。由于其特殊的生物相容性、高吸收和体内缓慢的溶解速率，它在医疗行业中占据主导地位，应用广泛。虽然HA的固有元素组成类似于牙齿和骨骼的矿物成分;它们表现出较差的机械强度和疲劳性能。这是由于与纳米HA相比，HA的晶粒尺寸更粗，限制了其在非承载应用中的应用。尽管具有优异的导电性和生物相容性，但低韧性和脆性的局限性导致了不可靠性2。目前，临床和实验研究主要围绕着开发具有仿生学特征的生物陶瓷，以克服这些限制并提高生物性能。特别是，将各种离子取代到HA的纳米结构中，以改变其生物相容性、烧结性和力学性能，反映了人们对其日益增长的兴趣1。因此，生物磷灰石的独特之处在于大量外源离子的存在，根据剂量有效地促进骨修复。生物磷灰石与化学计量HA的不同之处在于其磷灰石晶格上普遍存在不同数量的替代离子，包括阴离子(F−、Cl−、SiO44−和CO23−)和/或阳离子取代离子(Na+、Mg2+、K+、Sr2+、Zn2+、Ba2+、Al3+)3。在此之前，纯HA的断裂韧性在0.5-1 MPa m2 /2到2.7 MPa m2 /2的范围内得到了提高，浓度为5 at时，浓度为0.6 wt% Mg，浓度为1.5 MPa m2 /2。%锌。此外，这种阳离子取代增加了生物活性，表面反应性，并显示出良好的细胞增殖能力4。多离子取代或共取代等离子的掺杂也被报道产生多面属性5,6。

　　众所周知，HA晶格由于具有较高的结构灵活性，可以在其晶格内容纳周期体系中近一半的元素;允许不同的替代离子取代其三个亚晶格，即Ca2+， PO43−和OH−。因此，这种结合会影响HA的物理化学和生物特性。晶体结构、结晶度、热稳定性、表面电荷、溶解度、体外生物活性、体外破骨细胞和成骨细胞反应性以及体内骨再生3。二价阳离子(如Sr2+， Ba2+， Mg2+，…)和单价阳离子(如Na+， K+，…)主要替代Ca2+位点。这些阳离子在骨骼中的存在对骨骼的形成和再吸收有很大的贡献。例如，缺乏Mg2+离子会降低成骨细胞的生长速度，导致骨密度降低。而Zn2+离子通过加速生长速度促进骨形成，而Sr2+在人体内即使大剂量也无毒，具有促进骨形成和减少骨吸收的双重特性6,7,8。文献强调了这种离子取代HA材料的生物性能的提高9。Sr HA除了防止骨吸收和改善力学性能外，在体内兔模型中也表现出更高体积的新骨形成。同样地，Zn HA在大鼠和兔子模型体内分别植入1个月和2个月后也表现出增强的新骨形成。在新西兰白兔体内试验中，将Mg (15 at.%)作为股骨缺损的填充物，显示骨导电性增加4。

　　事实上，已知骨骼中存在的这种离子在血液中起缓冲作用，并直接影响成骨细胞和破骨细胞的增殖8。更有趣的是，一些离子(如Sr2+和Zn2+)会降低HA的结晶度，从而促进溶解，而其他离子(如F−)则会增强HA的结晶度，从而减少溶解10。此外，已知Sr2+和/或Zn2+可以抵消由于高浓度Ag离子引起的任何细胞毒性11。此外，在Zn2+和Mg2+共掺杂的nHA结构中观察到增强的宿主骨愈合而没有不良的细菌感染和炎症反应12。*近，一种由Sr2+和Mg2+(含5mol %的Sr和5mol %的Mg)纳米羟基磷灰石(n-HAs)与磷酸二钙和壳聚糖/明胶聚合物共取代的新型骨水泥显示出异常的成骨活性，可促进骨再生13。因此，这种离子的共取代结合了几种可取的特性，比HA的单独离子取代提供了有利的环境。然而，共取代离子的选择需要仔细考虑原子取代位点、相稳定性、生物影响和离子电荷平衡14。

　　本研究为了进一步增强合成的HA的性质和对称性，首次采用仿生合成方法研究了Serratia sp.生物矿化HA的离子取代15。研究了阳离子的单独和共取代，并对其在官能团、结晶度、形态和生物相容性方面的能力进行了表征。将细菌合成的HA与Sr、Zn和Mg离子组合共取代，以模拟生物磷灰石，并了解其在骨修复中的应用优势。对这种离子替代的研究可能有助于更好地理解生物矿化过程，以控制沉淀相的性质，增加生物活性和治疗骨病的离子输送16。

　　材料与方法

　　所有使用的化学试剂均为分析级。氯化钙(CaCl2)、氯化锶(SrCl2)、氯化锌(ZnCl2)、氯化镁(MgCl2)、柠檬酸三钠、三缓冲液和甲苯从印度SRL化学品公司采购。β-甘油磷酸二钠盐二水合物，对硝基苯磷酸盐(p-NPP)采购自Sigma-Aldrich(印度)。营养液、Dulbecco 's改良鹰鹰培养基(DMEM)、*低必需培养基(MEM)、抗生素青霉素-链霉素、胎牛血清(FBS)购自印度Himedia。

　　利用革兰氏阴性沙雷菌合成HA

　　粘质沙雷氏菌在锥形瓶中100ml营养肉汁培养基中培养，30°C孵育15小时。3500 rpm离心15分钟收集细胞，0.85% NaCl洗涤。将细胞悬液添加到由10mm氯化钙、25mm β-甘油磷酸二钠盐二水合物、20mm柠檬酸三钠和25mm三钠缓冲液组成的矿化介质中，pH调至8.517。沙雷氏菌在矿化介质中孵育10天后，收集白色沉淀物，在100℃下干燥7 h。

　　锶(Sr)或锌(Zn)或镁(Mg)取代的HA纳米颗粒的合成

　　矿化介质中的钙离子被Sr、Zn或Mg离子取代，得到相应的离子取代HA。确保培养基中离子的浓度不影响细菌培养条件是至关重要的。沙雷氏菌在前面“使用革兰氏阴性沙雷氏菌合成HA”章节中所述的条件下进行了HA的合成。将矿化介质中的CaCl2替换为3,5和10% SrCl2，收集到的沉淀分别为3% Sr SHA, 5% Sr SHA和10% Sr SHA。同样地，在矿化介质中以2、4和6% ZnCl2取代CaCl2，收集到相应的2% Zn SHA、4% Zn SHA和6% Zn SHA沉淀。同样地，2,4和6% MgCl2取代了CaCl2。而沙雷菌仅在2% MgCl2浓度下析出HA。收集2% Mg SHA沉淀，在100°C下干燥7 h并分析。

　　共取代HA的合成

　　为了开发一种类似于骨矿物的磷灰石，进行了离子共取代。这三种离子(Sr, Mg, Zn)在矿化介质中被1%的SrCl2, MgCl2, ZnCl2取代，如“使用革兰氏阴性细菌沙雷菌合成HA”部分所述，并通过沙雷菌进一步合成HA。沙雷菌仅在培养基中SrCl2、MgCl2、ZnCl2浓度的1%时析出HA。收集1% Sr, Mg, Zn SHA纳米颗粒粉末，在100°C下干燥7 h并分析。

　　合成的离子取代纳米颗粒的表征

　　采用FTIR、XRD、SEM、TEM和ICP-OES等技术对离子取代纳米颗粒和共取代纳米颗粒进行了表征。采用FTIR (Perkin-Elmer Spectrum Two, USA)在500-4000 cm−1范围内分析样品的官能团，分辨率为4 cm−1。采用Cu/Kα辐射(λ = 1.54 Å)，扫描速率为1 step/s，步长为0.10，用XRD (Bruker D8 discover powder XRD，德国)记录了样品的衍射图谱。利用“UnitCell”18程序计算XRD数据得到细胞体积和细胞参数。在10 kV加速电压下进行金溅射后，用配有能谱仪(FEI Quanta FEG 200，荷兰)的扫描电镜(SEM)对样品的表面形貌和元素组成进行了检测。在120 keV (Philips CM20 TEM, Netherlands)下，用透射电镜(TEM)测定了晶体的形貌和粒径。TEM样品是通过将分散在乙醇中的纳米颗粒滴入碳涂层的铜网格中制备的。使用ICP-OES Perkin Elmer Optima 5300 DV，美国对样品中几种离子的定量测量进行了评估。将10-15 mg样品粉末溶解在3 ml 1 M硝酸和27 ml蒸馏水中，并对总30 ml溶液进行ICP-OES分析。

　　生物相容性评价

　　用MTT法测定制备的纳米颗粒对NIH/3T3成纤维细胞、MG-63骨肉瘤细胞和RAW 264.7巨噬细胞的细胞毒性15,19,20,20。将细胞株在96孔板中培养至细胞密度为1 × 104 /孔，与细胞培养基孵育24小时21。细胞单层形成后，用浓度为100 μg μL−1的纳米颗粒处理细胞，孵育24 h。24 h后，取出培养液，PBS洗涤，然后用100 μL 0.5 mg mL−1的MTT[3-(4,5 -二甲基噻唑-2-基)- 2,5 -二苯四溴化铵]溶液替换每个孔培养基，继续孵育3 h，然后用200 μL DMSO(二甲基亚砜)替换MTT溶液。使用平板阅读器(Enspire, Perkin Elmer, USA)在570nm处测量井的光密度(OD) 22。样本中细胞活力的百分比相对于对照使用以下公式计算:

　　$$\% Cell\;viability = 100 \times \frac{OD\;of\;sample}{{OD\,of\;control}}$$

　　结果与讨论

　　单独和共取代SHA

　　研究的离子的浓度范围是根据先前的文献12,23选择的。在Sr和Zn取代SHA的情况下，在所有三种浓度上都成功沉积。然而，只有较低浓度的2% Mg supported HA deposition by Serratia. This is in line with the well-established inhibitory effect of Mg on HA nucleation and growth24,25. Mg substitution for Ca occurs only over a limited composition and in terms of bacterial deposition 2% was the threshold. Co-substitution was possible only with 1% of SrCl2, MgCl2, ZnCl2 concentration in the mineralization media.

　　红外光谱分析

　　三种离子取代和共取代(图1a, b, c, d)在不同浓度下的FTIR光谱显示了与SHA光谱相似的特征HA基团的存在。O-P-O弯曲振动的560,598 cm−1 (ν4)和P-O弯曲振动的1021 cm−1 (ν3)峰的存在表明了HA对应的磷酸基。这些结果与先前关于Sr, Zn和Mg取代的报道一致26,27。在1的情况下% Sr, Mg, Zn co-substituted SHA the most intense band of asymmetric stretching ν3, lower intensity bending modes of asymmetric ν4 doublet and faint symmetric stretching ν1 mode was witnessed, in line with prior results28.

　　此外，在1413 cm−1处的特征碳酸盐条带(ν3 -拉伸模式)被认为是HA晶格中部分取代的磷酸盐基团。而与CO32−重叠的HPO42−在872 cm−1处的强波段(ν2-弯曲模式)清楚地证明了离子取代。此外，a型HA在877-880 cm−1、1500 cm−1和1540-1550 cm−1波长处的特征振动和ab型HA在1515 cm−1波长处的特征振动均未观测到29。从而证实了SHA在所有离子取代中都存在b型碳酸化。由于这种b型碳酸磷灰石具有生物可吸收性、诱导成骨细胞反应和增强成骨细胞分化的能力，被认为是一种有效的骨替代材料30。CO32−的含量为5.8% in the case of co-substituted SHA and this is known to improve the bioactivity of HA owing to its resemblance with carbonated bone mineral phase.

　　用公式计算CO32 -代换率

　　$${\text{Wt}}.\% {\text{ CO}}_{{3}} = \, \left( {{28}.{62 } \times {\text{ r}}_{{{\text{c}}/{\text{p}}}} } \right) + 0.0{843}$$

　　其中r c/p是CO32−带(1570-1330 cm−1)和PO43−带(1230-900 cm−1)之间的面积比31,32。

　　由此可见，OH−离子从单位细胞中流失，证明Sr、Zn、Mg离子明显取代SHA晶格。先前报道了Mg取代HA在630 cm−1和3570 cm−133处OH-振动模式强度的降低。同样，在Zn取代HA的情况下，OH -的拉伸振动模式被报道为较低，这是由于OH -和PO43-34之间由氧产生的氢键。

　　还值得注意的是，文献表明离子浓度的增加对应于结晶度的降低。然而，在本研究中，由于所研究的浓度较低，这四种情况中的任何一种都没有出现这种峰的扩大。*后，在3374 cm-1处的宽频带对应于吸附在表面的水35。

　　XRD分析

　　对比了SHA和离子取代HA粉体的XRD谱图(图2a, b, c和d)，在所有情况下，与HA相关的反射均与参考文献JCPDS 09-0432相关。可见HA结晶度较低的特征峰。没有证据表明有任何二次相，如货币石或刷石，因此所获得的产品都是纯相5。据报道，峰展宽的增加与晶体尺寸的减小直接相关。这种低分辨率的峰描述了纳米尺度(≤100纳米)的性质和HA晶格内可观的取代水平26。此外，在独特的HA峰没有明显的变化被记录，可能是由于较低的离子浓度研究5,6。

　　关于结晶度，报告讨论了离子对细胞体积和晶格参数的影响。表1描述了所有样品的晶格参数a和c以及单位细胞的六边形体积(图2a, b, c和d)。锶比HA结构的Ca (I)更倾向于排列在“交错”等边三角形顶点的Ca (II)位点。由于其较高的离子半径大于钙，容易容纳在Ca (II)中。这种占用偏好可能是结晶度降低的原因。此外，通过将单位细胞从526.46扩大到540.15 Å336进行验证。相反，与Sr SHA相比，Zn SHA和Mg SHA显示细胞体积减少，在2% Mg SHA的情况下为526.46至524.1 Å3，在6% Zn SHA的情况下为517.79 Å3，与先前的报道一致33。

　　此前，Matsunaga等人通过第一性原理计算建立了二价阳离子与HA的离子交换能力。离子交换能力取决于离子的大小。对于Ni2+、Mg2+、Cu2+和Zn2+等尺寸较小的阳离子，第一个*近邻(NN)氧离子优先于Ca (I)位。然而，在Ca (I)位点的大尺寸阳离子Sr2+， Pb2+， Ba2+的情况下，第一个NN氧离子被看到从Ca (I)位点移出它们的位置37。

　　沿着这些路线，由于Mg2+的离子半径较小(即0.69 vs. 0.99 Å)，用Mg2+替代Ca2+使单位细胞更小，并由于晶格畸变导致结晶度降低。类似地，HA晶格内较小的Zn2+离子取代Ca2+离子，导致单位细胞参数的收缩38。本质上，Sr2+和Ca2+的离子半径差小于Zn2+和Mg2+与Ca2+的离子半径差。因此，在Sr, Zn, Mg SHA含量为1%的情况下，细胞体积增加至531.07 Å3。值得注意的是，如前所述，具有10% Sr SHA取代的Sr反映了*大的细胞体积，表现出其在SHA晶格中的取代优势，无论是单独取代还是共取代形式。众所周知，镁离子会破坏HA结构的稳定，促进β-TCP(磷酸三钙)的形成，而锶离子能够很容易地在HAp晶格中取代，保持单一的HAp相33。由于Sr的加入带来了相纯度和稳定效果，从而实现了高效的取代平衡。

　　在晶格参数方面，“a”和“c”的变化是取代HA的理想选择。然而，“a”和“c”的变化程度取决于取代基的类型和取代量(表1)。取代对HA晶格参数和倾斜溶解度的详细影响已在前面说明9。在这里，细化记录了晶格参数a和c随着Zn取代降低到6%，这也与Li et al.34的观察结果一致。Zn - SHA在“c”格中呈现不规则的趋势。早期的报告报告了随着锌浓度的增加而降低的值39。然而，一些报道也将观察到的晶格参数“c”的增加，在六方轴2b位点占据了一个新的位置，在这个位置上，Zn将邻近的O4(羟基- o)原子分开，通过吸引O3(磷酸- o)原子和缩小“a”方向40或通过H2O分子简单地取代OH-基团而扩大c方向并扭曲了附近的磷酸盐四面体39。